Adaptation métabolique à l'auxotrophie vitaminique par la feuille

The ISME Journal volume 16, pages 2712–2724 (2022)Citer cet article

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Les auxotrophes sont incapables de synthétiser tous les métabolites essentiels à leur métabolisme et comptent sur les autres pour les fournir. Ils ont été étudiés de manière intensive chez des mutants générés et évolués en laboratoire, mais les mécanismes d'adaptation émergents à l'auxotrophie n'ont pas été systématiquement abordés. Ici, nous avons étudié les auxotrophes de bactéries isolées à partir de feuilles d'Arabidopsis thaliana et avons constaté que jusqu'à la moitié des souches avaient des besoins auxotrophes en biotine, niacine, pantothénate et/ou thiamine. Nous avons ensuite exploré la base génétique de l'auxotrophie ainsi que les traits qui coapparaissaient avec l'auxotrophie vitaminique. Nous avons constaté que les souches auxotrophes stockaient généralement des coenzymes capables de croître de manière exponentielle pendant 1 à 3 fois sans supplémentation en vitamines ; cependant, le stockage le plus élevé observé concernait la biotine, ce qui permettait 9 doublements dans une souche. Dans des expériences de co-culture, nous avons démontré l'apport de vitamines aux auxotrophes et avons constaté que les souches auxotrophes maintenaient une richesse en espèces plus élevée que les prototrophes lors d'une supplémentation externe en vitamines. L'extension d'un modèle consommateur-ressource a prédit que les auxotrophes peuvent utiliser des composés carbonés fournis par d'autres organismes, suggérant que les souches auxotrophes bénéficient de sous-produits métaboliques au-delà des vitamines.

Les coenzymes sont essentielles au métabolisme cellulaire. Ils forment le cœur de nombreuses réactions catalysées par des enzymes (par exemple, les réactions redox, les transaminations et la formation de liaisons carbone-carbone) et agissent comme supports pour les unités à un carbone et les acides organiques [1]. Les organismes présentant des défauts dans leur biosynthèse, les auxotrophes, doivent obtenir des coenzymes ou des molécules précurseurs de coenzymes, c'est-à-dire des vitamines par apport externe. Parce qu'ils dépendent de l'apport de vitamines dans leur environnement pour permettre leur croissance, l'instabilité des coenzymes exacerberait le besoin d'un apport externe. Il a récemment été montré que le squelette carboné des coenzymes est stable in vivo [2]. En fait, la longévité des coenzymes, c'est-à-dire l'absence de dégradation et de reconstruction intracellulaire, est une propriété inhérente qui aurait pu être sélectionnée pour l'évolution [2, 3] et peut être considérée comme une condition préalable à la prolifération d'organismes auxotrophes. Les exigences auxotrophes peuvent évoluer rapidement dans des expériences d'évolution en laboratoire dans des milieux riches en nutriments, comme le montrent les populations d'Escherichia coli [4]. Des souches auxotrophes ont également été isolées de la nature et sont souvent le résultat d'une perte de gènes [5,6,7]. Cependant, on ne sait pas actuellement à quel point les auxotrophes sont courantes chez les bactéries dans la plupart des environnements. Un certain nombre d'études récentes ont rapporté des prédictions sur les besoins nutritionnels directement à partir de données génomiques en utilisant des modèles métaboliques à l'échelle du génome ou en identifiant des lacunes dans les génomes sans validation expérimentale [8,9,10,11,12,13] ou en concentrant la validation expérimentale sur quelques souches [14,15,16]. Ces études ont été utilisées pour prédire les réseaux d'interaction des communautés microbiennes, qui à leur tour ont servi à déduire l'alimentation croisée métabolique dans les communautés bactériennes [17]. La fréquence des auxotrophies pour les coenzymes, les nucléobases et les acides aminés dans les bactéries séquencées a été estimée dans des analyses informatiques et pourrait atteindre 75 % [13], bien que ces analyses présentent probablement un taux élevé de faux positifs par rapport aux données obtenues expérimentalement [ 18].

Les auxotrophes nécessitent un apport externe en vitamines, ce qui pose la question des adaptations physiologiques ou autres des auxotrophes, notamment le stockage des vitamines. On sait depuis longtemps que les bactéries lactiques auxotrophes maintiennent leur croissance après l'élimination des vitamines [19]. Bien que le stockage intracellulaire de composés élémentaires tels que le carbone, le phosphore et l'azote ait été démontré [20,21,22], le stockage de petites molécules, y compris les vitamines et les coenzymes, n'est actuellement pas bien établi. On ne sait pas non plus à quel point le stockage potentiel est répandu dans les bactéries environnementales. Il existe un regain d'intérêt pour évaluer le stockage de divers composés en raison des implications écologiques de la capacité des microbes à maintenir la croissance sans accès externe aux ressources [23]. Les souches prototrophes d'E. coli qui ont été mutées dans des gènes impliqués dans la biosynthèse des coenzymes, c'est-à-dire des mutants auxotrophes "artificiels", ont une capacité de stockage d'environ un double seulement après élimination de la vitamine essentielle [2]. Ce double pool excédentaire de coenzymes est probablement l'exigence minimale pour maintenir le métabolisme robuste à l'expansion cellulaire pendant la division cellulaire. Ces résultats nous ont amenés à émettre l'hypothèse que pour les auxotrophes trouvés dans la nature où l'apport de coenzymes peut être erratique, différentes stratégies pour faire face à la dépendance aux nutriments et au stockage des coenzymes peuvent avoir évolué. La perte de biosynthèse d'un composé pourrait également affecter la fonction d'une cellule d'une manière plus systémique. Les conséquences physiologiques directes résultant de la perte de biosynthèse ont été étudiées dans des organismes modèles tels que E coli, Bacillus subtilis et Acinetobacter baylyi et incluent le bénéfice de la forme physique [4, 13, 24] et le potentiel d'alimentation croisée [25, 26]. Ces études montrent que, tant que le nutriment requis est disponible, les auxotrophes surpassent le type sauvage. On peut prévoir qu'avec un temps d'évolution suffisant, d'autres traits pourraient être sélectionnés pour compenser la perte d'une capacité de biosynthèse. Cette perte d'une fonction essentielle, par exemple, une voie de biosynthèse particulière, peut alors s'étendre à d'autres composés disponibles dans la niche désormais obligatoire, ainsi qu'à des caractéristiques qui aident à faire face à la pénurie de nutriments. Ce dernier pourrait impliquer, par exemple, l'optimisation de l'utilisation des coenzymes auxotrophes dans les voies métaboliques, l'augmentation du stockage des vitamines, l'investissement de plus d'énergie dans les systèmes de réparation ou l'optimisation des taux de croissance et d'absorption des nutriments [9, 27, 28, 29].

Ici, nous étudions d'abord l'occurrence d'auxotrophies dans la collection At-LSPHERE, qui se compose de 224 souches isolées à partir de feuilles de plantes Arabidopsis thaliana poussant dans la nature [30]. Les souches ont été isolées sur un milieu rempli de vitamines et d'acides aminés, ce qui permet des expériences systématiques d'élimination des nutriments pour examiner les auxotrophies au sein de la collection de souches. Nous examinons ensuite si les souches auxotrophes maintiennent un stockage de coenzyme plus élevé que les souches prototrophes et explorons les traits génomiques qui coexistent (et potentiellement co-évoluent) avec l'auxotrophie. Enfin, nous examinons l'acquisition de vitamines ainsi que l'aptitude auxotrophique dans des expériences de co-culture.

Pour identifier les souches auxotrophes pour cette étude, nous avons criblé une collection de souches représentative de 224 membres (At-LSPHERE) [30]. Brièvement, des triplicats de chaque souche ont été cultivés dans des plaques à 96 puits remplies de milieux liquides additionnés de vitamines ou d'acides aminés, avec les deux types de composés, ou sans suppléments. Des mesures de densité optique à haut débit (OD600) ont été utilisées comme lecture de la croissance. Nous avons constaté que sur les 156 souches qui se sont développées dans le milieu, 50% (78) avaient besoin de suppléments pour leur croissance et étaient donc probablement auxotrophes (Fig. 1 supplémentaire). L'auxotrophie était particulièrement fréquente chez les actinobactéries et les alphaprotéobactéries, dont plus de la moitié des souches testées étaient auxotrophes. Parmi ces 78 souches, nous avons sélectionné 50 auxotrophes putatifs pour une caractérisation plus poussée dans des milieux d'abandon individuels et avons constaté que la plupart des auxotrophes vitaminiques concernaient la biotine, la thiamine, la niacine et le pantothénate pour lesquels nous avons trouvé 10 auxotrophes ou plus chacun (Fig. 1a; Supplémentaire Fig. 1).

a Auxotrophies vitaminiques concomitantes déduites du manque de croissance sans une vitamine donnée dans un criblage sur milieu d'abandon pour 50 souches. La niacine, le pantothénate, la biotine et la thiamine étaient les vitamines les plus couramment nécessaires. L'épaisseur des bords correspond au nombre de souches dans lesquelles les deux auxotrophies putatives coexistent. PABA = acide para-aminobenzoïque. (Données source dans Source Data 1.) b Expériences représentatives d'épuisement dynamique des vitamines. La croissance est présentée comme un doublement dans le temps. À t = 0, un passage de la préculture supplémentée avec les quatre vitamines à un milieu appauvri en vitamines (lignes colorées) ou, en tant que témoin, à un milieu supplémenté (ligne noire) a été effectué. Si une souche était auxotrophe pour une vitamine donnée, elle épuisait cette vitamine après un certain temps et arrêtait de croître ; par exemple, Aureiomonas Leaf324 a été trouvé auxotrophe pour les quatre vitamines. Le moment auquel les cultures appauvries en vitamines et complétées ont dévié sont visualisés sur le tracé linéaire pour les trois répétitions séparément (voir Matériels et méthodes pour plus de détails). (Données source dans Source Data 2.) c Carte thermique de l'auxotrophie. La couleur claire fait référence aux composés sans lesquels la croissance d'une souche s'écarte du témoin supplémenté et donc la souche est auxotrophe pour. Par exemple, pour Aureiomonas Leaf324, les 4 colonnes d'appauvrissement sont gris clair lorsque sa croissance a cessé sans chacun des composés individuellement. (Données source dans Source Data 3.) d Stockage de coenzymes dans des souches auxotrophes (intervalle interquartile et médiane). Le nombre de doublements en l'absence de la vitamine indiquée correspond à la capacité de stockage. (Données source dans Données source 3).

Données sources 1Données sources 2Données sources 3Données sources 3.

Bien qu'il soit utile de caractériser les besoins en nutriments de nombreuses souches en parallèle, l'application d'un écran pour élucider les besoins en nutriments d'une souche individuelle est limitée en raison de la gamme linéaire de lecteurs de plaques, ce qui pourrait conduire à de fausses prédictions. Pour surmonter cette limitation et pour une analyse plus approfondie, nous avons sélectionné 22 souches de divers phylums qui ne formaient pas d'agrégats lors de la croissance en milieu liquide, ce que nous avons assuré visuellement et en confirmant que leurs nombres d'unités formant colonies étaient dans la plage attendue (ordre de 1e9 /ml) (tableau supplémentaire 1 ; voir les souches sélectionnées dans le tableau supplémentaire 2). Nous avons cultivé chaque souche dans des cultures discontinues semi-continues et surveillé la DO600 à des intervalles de 10 minutes, en diluant chaque puits avec du milieu frais après chaque doublement pour assurer une croissance exponentielle continue. Nous avons utilisé ces données pour examiner la croissance de chacune des souches sur des milieux minimaux de glucose complétés par de la biotine, de la niacine, de la thiamine et du pantothénate, et avons observé que toutes les souches se développaient en présence de ces quatre vitamines (trajectoires noires sur la figure 1b et la figure supplémentaire . 2). Par la suite, nous avons effectué des expériences de croissance en passant des cellules à des milieux sans vitamines (voir Méthodes), exposant ainsi les cellules à une déplétion en vitamines. Nous avons classé une souche donnée comme auxotrophe si sa croissance dans un milieu d'abandon de vitamine s'écartait des cultures témoins supplémentées (superposition de nuages ​​de points sur la Fig. 1b et la Fig. 2 supplémentaire). Les 22 souches ont ainsi été confirmées comme étant auxotrophes dans cette expérience (Fig. 1c). Plus précisément, chaque souche était auxotrophe pour deux vitamines en moyenne, et 80 % des souches étaient auxotrophes pour plusieurs vitamines.

À l'intérieur des cellules, les vitamines sont transformées en coenzymes. Les coenzymes sont catalytiquement très réactives, mais stables [2]. Parce qu'ils ne sont pas consommés dans les réactions métaboliques et ne sont synthétisés que pour compenser la dilution par la croissance, les coenzymes ou leurs précurseurs sont potentiellement stockables dans les cellules. Pour évaluer le potentiel de stockage intracellulaire des vitamines dans les souches auxotrophes sélectionnées, nous avons utilisé les données de croissance semi-continue pour calculer le nombre total de doublements que chaque souche a obtenus après une privation de vitamine avant de s'écarter de la croissance exponentielle, déterminée par comparaison avec des cultures témoins supplémentées (Fig. 1b ; Fig. 2 supplémentaire). Ces valeurs peuvent ainsi servir d'indicateurs du stockage des vitamines. Nous avons constaté que la plupart des souches avaient un stockage de vitamines permettant 1 à 2 doublements, ce qui était similaire à celui des mutants d'E. coli [2]. Cependant, nous avons également observé que certaines souches auxotrophes maintenaient une croissance exponentielle pendant une période prolongée après l'élimination de la biotine, se traduisant par 4 à 5 doublements en utilisant les réserves de biotine (pool excédentaire de 16 à 32 fois). Une souche, Chryseobacterium Leaf201, avait un réservoir qui permettait 9 doublements (excès de 512 fois) après le retrait de la vitamine (Fig. 1d). Nous avons également confirmé de manière exemplaire pour Rhizobium Leaf68 que l'arrêt de la croissance coïncide avec l'épuisement intracellulaire de la coenzyme (Fig. 3 supplémentaire).

Connaissant les besoins en vitamines de 22 souches validées, nous avons ensuite entrepris d'identifier la base génétique potentielle des auxotrophies observées en analysant les voies de biosynthèse des vitamines à l'aide de l'annotation Clusters of Orthologous Groups of Proteins (COG). En tant que témoins prototrophes, nous avons étudié 13 souches supplémentaires dont nous avons confirmé la croissance sur un milieu minimal sans suppléments (Fig. 4 supplémentaire). Tout d'abord, nous avons demandé si nous aurions pu prédire l'auxotrophie observée à partir des seules données génomiques. Suite à des rapports antérieurs dans lesquels le pourcentage de gènes biosynthétiques absents d'une voie a été utilisé comme marqueur d'auxotrophie [12, 13, 14, 15, 31], nous avons étudié la fraction de termes COG biosynthétiques présents sur les quatre voies de synthèse des coenzymes. Toutes les souches, y compris les prototrophes, manquaient de nombreuses étapes de biosynthèse dans les voies pour les quatre coenzymes étudiées (biotine, thiamine, coenzyme A, NAD), et nous n'avons pas observé systématiquement moins d'étapes de voie chez les auxotrophes (Fig. 2). Nous avons ensuite demandé si la déduction des auxotrophes à partir de la présence/absence de gènes individuels se traduirait par une meilleure prédiction des auxotrophes validées expérimentalement. À cette fin, nous avons comparé la fréquence à laquelle chaque terme COG d'une voie de biosynthèse des vitamines était présent pour le groupe auxotrophe par rapport au groupe prototrophe à l'aide d'un test du chi carré. De cette manière, nous avons identifié 1 à 3 gènes absents suffisants pour expliquer chaque auxotrophie (tableau 1). Pour plus de détails sur la nature des réactions spécifiques, voir la note complémentaire 1.

une fraction de termes COG de chaque voie de biosynthèse des coenzymes (lignes) présentes dans chaque souche (colonnes) ; les souches sont codées par couleur par phylum et regroupées par pourcentage de voie présente. Les rectangles noirs indiquent que la souche correspondante s'est avérée auxotrophe pour la coenzyme dans cette étude (Fig. 1).

Après avoir identifié 1 à 3 gènes probablement responsables de chaque auxotrophie observée, nous avons cherché à savoir si les résultats s'appliquaient également aux souches auxotrophes restantes de la collection de souches At-LSPHERE (Fig. 1c et Fig. 1a supplémentaires). Pour y parvenir, nous avons voulu créer des classificateurs robustes pour chacune des quatre exigences auxotrophes observées. Nous avons d'abord généré un échantillon de 63 souches auxotrophes, dont 35 ont été validées ci-dessus et 28 souches supplémentaires pour lesquelles les prédictions de la Fig. 1c supplémentaire ont été utilisées comme variable cible. Deuxièmement, nous avons formé un classificateur d'arbre de décision basé soit sur les 1 à 3 caractéristiques sélectionnées dans l'analyse du chi carré (tableau 1), soit sur un nombre égal de caractéristiques sélectionnées au hasard. Ces modèles ont atteint des mesures de performance de 80 à 100 % (Fig. 5 supplémentaire). Nous avons utilisé les modèles pour prédire l'auxotrophie de 139 souches de la collection At-LSPHERE pour lesquelles une croissance a été observée dans le milieu supplémenté (et donc comparables en physiologie) et pour lesquelles des annotations COG étaient disponibles (tableau supplémentaire 3). Nous avons également utilisé ces caractéristiques pour réétudier l'auxotrophie au niveau taxonomique. Les termes COG que nous avons identifiés comme absents de l'analyse reproduisaient l'enrichissement phylogénétique estimé pour l'auxotrophie chez les actinobactéries et les alphaprotéobactéries étroitement apparentées à Rhizobium spp. (Fig. 6 supplémentaire ; comparer à la Fig. 1 supplémentaire).

La réduction du génome a déjà été décrite chez des bactéries auxotrophes environnementales [32]. Nous avons ainsi abordé la réduction du génome et les événements potentiels de perte de gènes concomitants pour les 139 souches pour lesquelles des prédictions d'auxotrophie étaient possibles sur la base de l'annotation génomique fonctionnelle et de la croissance observée dans un milieu défini (Fig. 6 supplémentaire). En effet, nous avons trouvé des génomes significativement plus petits chez les auxotrophes par rapport aux prototrophes (Fig. 3a). Cet effet était néanmoins dépendant de la classe/phylum : la réduction du génome était significative chez les actinobactéries (19 % de génomes plus petits), une fraction élevée (> 50 %) des souches étant auxotrophes (Fig. 1b supplémentaire). Comme il n'y a que six espèces de Firmicutes dans les souches analysées, il est difficile de tirer des conclusions générales. Cependant, les quatre auxotrophes présentent un génome qui ne faisait que la moitié de la taille des deux souches prototrophes et présentent également moins de cadres de lecture ouverts (Fig. 7 supplémentaire). Les souches auxotrophes identifiées ici nécessitaient en moyenne deux acides aminés et deux vitamines (Fig. 1, Fig. 1 supplémentaire). Par conséquent, la perte observée de gènes biosynthétiques représenterait 0, 25% de génomes plus petits chez les auxotrophes (pour une bactérie qui code en moyenne 5 000 gènes; estimée sur la base de la figure 3a). Ainsi, notre observation selon laquelle les auxotrophes ont des génomes plus petits soulève la question de savoir s'il existe d'autres processus ou voies biologiques associés à l'auxotrophie qui expliquent la réduction du génome.

Les génomes obtenus à partir de RefSeq avec les numéros d'accession dans Source Data 5. Dans tous les panels, 139 souches qui se sont développées dans des cultures liquides (Fig.1 supplémentaire) et pour lesquelles des annotations COG étaient disponibles ont été incluses. Le statut d'auxotrophie a été prédit à l'aide des modèles de la figure 2 et du tableau 1. a Tailles du génome entre les auxotrophes et les prototrophes. b Nombre de réactions nécessitant chaque coenzyme dérivée de la vitamine (axe des abscisses) dans les souches auxotrophes par rapport aux prototrophes pour chaque coenzyme (dans des parcelles séparées). Par exemple, le premier graphique en haut à gauche montre une comparaison de l'utilisation de coenzymes de 6 coenzymes entre les auxotrophes et les prototrophes de la biotine. Les modèles métaboliques ont été obtenus en exécutant CarveMe [33] sur les numéros d'accès RefSeq. c Voies sur lesquelles > 20 % des gènes étaient différentiellement présents entre les auxotrophes et les prototrophes pour chaque vitamine. Ici, "sous-représenté" fait référence à moins abondant en auxotrophes.

Données sources 5.

Une adaptation génomique concevable qui lierait l'auxotrophie à la réduction du génome est que les souches auxotrophes ont évolué pour être moins dépendantes des coenzymes qu'elles ne peuvent pas synthétiser. Cependant, le scénario inverse est également plausible : si la vitamine est librement disponible dans l'environnement, il pourrait y avoir une pression de sélection positive pour préférer les coenzymes aux vitamines gratuites. Pour rechercher s'il existe une corrélation (positive ou négative) entre l'auxotrophie pour une coenzyme donnée et son utilisation en termes de nombre d'enzymes, nous avons créé des modèles métaboliques à l'échelle du génome pour toutes les souches individuelles (GEM) [33]. Dans l'ensemble, le nombre de réactions dans les modèles métaboliques était similaire dans les deux groupes (Fig. 7 supplémentaire), ce qui indique que les auxotrophes n'ont pas de réseaux métaboliques rationalisés. Nous avons cherché à savoir si les souches auxotrophes utilisent préférentiellement une coenzyme plutôt qu'une autre dans leurs réactions enzymatiques ; en particulier, les auxotrophes de la niacine peuvent potentiellement utiliser des enzymes dépendantes de FAD ou FMN au lieu de celles dépendantes de NAD (P). À l'aide de GEM, nous avons calculé le nombre d'enzymes qui nécessitent chaque coenzyme pour les auxotrophes et les prototrophes afin de mesurer le degré de dépendance d'une souche à la vitamine correspondante. Bien que les GEM n'incluent pas d'informations sur les niveaux d'expression des enzymes individuelles en question (et donc l'exigence différentielle potentielle de l'enzyme), leurs contraintes stoechiométriques et leur structure de réseau offrent une plus grande confiance pour l'expression des gènes que l'analyse génomique seule. Nous avons constaté que pour la plupart des coenzymes, les auxotrophes et les prototrophes avaient le même nombre de réactions (Fig. 3b). Les auxotrophes de niacine avaient 10% d'enzymes en plus en utilisant NAD(H) et 20% en moins en utilisant FAD(H) (valeur p <0,05, test χ2), indiquant une préférence pour l'utilisation de la coenzyme pour laquelle la biosynthèse est perdue. Pour la biotine, les souches auxotrophes avaient 15% d'enzymes dépendantes de la biotine en plus (valeur p <0,05, test χ2). Dans l'ensemble, cette analyse montre que la réduction du génome observée dans les souches auxotrophes ne peut pas systématiquement être expliquée par moins d'enzymes qui nécessitent le coenzyme respectif. En tant que tel, la capacité métabolique peut ne pas être réduite chez les auxotrophes, et les auxotrophes peuvent avoir attribué leurs réactions métaboliques à l'utilisation des vitamines essentielles.

Outre l'impact direct sur l'utilisation des coenzymes, nous avons estimé que les souches auxotrophes pourraient avoir développé d'autres traits indirectement liés à l'utilisation des coenzymes, avant ou après être devenus auxotrophes. De tels traits pourraient entraîner la perte d'événements fonctionnels dans d'autres voies de biosynthèse, ainsi que la perte de gènes qui ne sont pas essentiels dans la niche confinée, comme l'utilisation d'une source de carbone. Nous avons donc cherché à aborder la réallocation métabolique de manière plus générale. Pour trouver des gènes dont la présence est en corrélation avec l'auxotrophie, nous avons effectué une analyse génomique fonctionnelle à l'échelle du génome. Nous avons d'abord évalué si chaque terme COG était différentiellement abondant entre les auxotrophes et les prototrophes, puis avons cartographié les termes COG significativement différents aux voies. La signification a été déterminée par le test χ2 et plusieurs tests de correction ont été effectués avec le FDR. De cette manière, nous avons identifié un ensemble de différences conservées entre les auxotrophes et les prototrophes (Fig. 3c, Tableau supplémentaire 4). Dans l'ensemble, le schéma était dominé par la perte de fonction chez les auxotrophes. En fixant le seuil des termes COG différentiellement abondants à 20% de tous les gènes de la voie, nous avons récupéré la voie de biosynthèse pour chaque auxotrophie connue, ce qui a confirmé que cette approche peut capturer des différences biologiquement significatives entre les groupes. D'autres absences de gènes entraînaient une perte de fonction enzymatique dans l'énergie, en particulier le métabolisme du glucose ainsi que d'autres voies de biosynthèse telles que les acides aminés et d'autres coenzymes au-delà de celles testées ici, alors que les systèmes de récupération étaient plus répandus dans le groupe auxotrophe.

Des expériences de co-culture peuvent être utilisées pour fournir des informations sur les interactions bactériennes dans les communautés microbiennes [34,35,36,37]. Ici, nous avons demandé si les auxotrophes avaient accès aux vitamines des prototrophes co-cultivés. À cette fin, nous avons sélectionné des souches vitaminiques auxotrophes (n = 10) et prototrophes (n = 10) phylogénétiquement représentatives pour une expérience de co-culture (Fig. 4a). Nous avons mené une expérience de dilution en série du mélange de souches (3 répétitions biologiques chacune en 3 répétitions techniques) dans un milieu minimal additionné de glucose 20 mM et des 20 acides aminés protéinogènes (100 μM chacun). Les médias ne différaient que par le fait qu'ils étaient supplémentés en vitamines. (Fig. 4b, c). Les cultures ont été analysées à intervalles réguliers par séquençage du gène ARNr 16S pour déterminer la composition relative des espèces bactériennes. La croissance dans les deux conditions était comparable (Fig. 4c). Nous avons observé que le profil d'abondance relative entre les milieux était similaire dans les deux groupes, c'est-à-dire les auxotrophes et les prototrophes, et indépendamment du fait que les vitamines aient été complétées ou non (Fig. 4d, colonnes grises vs orange pour chaque souche; Fig. 8 supplémentaire). La seule espèce auxotrophe qui a bénéficié d'une supplémentation en vitamines était Pedobacter Leaf132 (valeur de p 0,003, rm-ANOVA). Deux souches auxotrophes, Rhizobium Leaf202 et Arthrobacter Leaf137, présentaient des abondances relatives plus élevées dans les cultures où les vitamines n'étaient pas supplémentées (valeurs p <0, 01 rm-ANOVA). Cette analyse montre donc que le manque de supplémentation externe en vitamines n'empêche pas la croissance des auxotrophes lorsqu'ils sont cultivés dans une communauté avec des souches prototrophes et suggère un croisement vitaminique.

a Sélection de souches pour co-cultures. Au total, 20 souches ont été choisies pour représenter la diversité phylogénétique du microbiote foliaire d'A. thaliana. Le regroupement est basé sur des séquences de gènes d'ARNr 16S pleine longueur. b Les souches présentées dans le panneau A ont été mélangées en nombre égal (voir Méthodes pour plus de détails) dans trois inoculums biologiques. Chaque inoculum a été utilisé pour inoculer trois répétitions techniques sous deux régimes de croissance : milieu minimal avec et sans vitamines, ce qui a donné 18 cultures. Les 20 acides aminés protéinogènes ont été ajoutés à toutes les cultures (100 uM). c Mesures de croissance des cultures de b Les cultures ont été cultivées pendant un total de 120 h et diluées à 24, 48 et 72 h. À 9, 24, 48, 72, 96 et 120 h (indiqués par des points), des échantillons pour le séquençage du gène ARNr 16S (cellules) et LC/MS (surnageants) ont été prélevés. d Abondance relative des 20 souches (colonnes) dans l'expérience de co-culture. Pour chaque souche, la moyenne des trois réplicats techniques pour chaque réplicat biologique est indiquée comme le changement d'abondance relative par rapport au point de temps précédent, d'abord dans un milieu minimal avec des vitamines (colonnes étiquetées avec des cases orange), puis dans un milieu minimal sans vitamines (colonnes marquées en gris). Pour chaque souche, les trois répétitions dans la même condition sont séparées par de fines lignes blanches et les deux conditions sont séparées par des lignes grises épaisses. Les 20 souches sont séparées par des lignes noires épaisses. Les souches sont regroupées par phylogénie, calculée à partir de l'alignement du gène de l'ARNr 16S.

Pour évaluer la présence d'alimentation croisée, nous avons examiné les milieux épuisés des co-cultures mentionnées ci-dessus (Fig. 5). Nous avons mesuré les milieux sans bactéries (point de temps 0 h) ainsi que les surnageants après 9 h et 24 h de co-culture. Nous avons d'abord comparé les pools de vitamines dans les deux conditions (± vitamines). Lorsque les vitamines étaient supplémentées, la concentration de niacine, de pantothénate et de thiamine diminuait entre 0 h et 9 h, puis entre 9 h et 24 h, suggérant une absorption nette par les bactéries cultivées dans le milieu (série orange sur la figure 5a). Une diminution des pools vitaminiques de ces quatre vitamines était attendue étant donné que la moitié des souches inoculées étaient auxotrophes pour une ou plusieurs d'entre elles. La concentration de biotine, cependant, n'a pas diminué au cours de l'expérience (série orange dans le premier panneau de la figure 5a) bien que presque toutes les souches soient auxotrophes pour elle, indiquant soit de faibles taux d'absorption de biotine par les auxotrophes, soit que les souches prototrophes sécrètent de la biotine à des taux comparables à l'absorption de biotine par des souches auxotrophes. Nous avons également observé l'absorption de pyridoxal, pour lequel aucune souche n'était auxotrophe. La concentration de riboflavine était inférieure à la limite de détection dans le milieu sans bactéries, mais elle s'est constamment accumulée dans le milieu pendant la croissance bactérienne, ce qui suggère qu'au moins une des souches de la co-culture a sécrété plus de riboflavine que d'autres. Dans le milieu appauvri en vitamines, nous avons trouvé une accumulation de niacine, de pantothénate et de pyridoxal à 9 h, suivie d'une diminution de ces vitamines à 24 h, ce qui implique que les bactéries ont d'abord sécrété ces vitamines dans le milieu et les ont ensuite absorbées ( Fig. 5a, série grise). Les pools de thiamine et de biotine sont restés sous la limite de détection. Les acides aminés qui ont été complétés dans les deux milieux (aux côtés du glucose comme seule source de carbone principale) ont diminué dans toutes les co-cultures par rapport au milieu pur, indiquant une absorption nette du milieu (Fig. 5b). La majorité du glutamate fourni (une source attractive de carbone et d'azote [38]) était encore disponible après 9 h de co-culture et principalement consommée pendant la phase stationnaire.

a Série chronologique de la consommation de vitamines dans les co-cultures mesurée à partir des surnageants de co-culture. Pour chaque vitamine, le log10 de la surface de pic normalisée du courant ionique total est d'abord indiqué dans les cultures supplémentées en vitamines, puis pour les cultures appauvries en vitamines. b Acides aminés mesurés à partir des surnageants de co-culture. Les données sont des aires de pic transformées en log10 normalisées au signal du milieu qui a été complété avec des acides aminés dans les deux milieux (+ et -vitamines). Chaque cellule de la carte thermique représente la moyenne de 9 répétitions.

Les mutants auxotrophes ont souvent un avantage de fitness par rapport aux souches ancestrales prototrophes dans les expériences de compétition par paires [13, 24, 39]. Dans l'analyse suivante, nous avons évalué si cela est également vrai dans un contexte communautaire d'auxotrophes et de prototrophes naturels. Plus précisément, nous avons prédit la richesse en espèces à partir du taux de croissance et du rendement de chaque souche dans des cultures individuelles et avons comparé ces prédictions aux données obtenues expérimentalement (Fig. 4). Nous avons effectué l'analyse des données d'abondance relative dans un milieu minimal supplémenté en vitamines (colonnes orange sur la Fig. 4d) en comparant la richesse spécifique (nombre d'espèces détectées divisé par le nombre d'espèces initialement introduites dans la co-culture) au cours du temps dans le deux groupes : les auxotrophes et les prototrophes. Nous avons constaté que les deux tiers des souches n'étaient pas détectées et donc interprétées comme perdues après les deux premiers cycles de dilution (après 24 h et 48 h) avant de se stabiliser finalement à 72 h (Fig. 6a). Plus de souches ont été perdues dans le groupe prototrophe : les trois quarts des prototrophes n'ont pas été détectés après 48 h, soit nettement moins que les auxotrophes, où seulement la moitié n'ont pas été détectées (p ≪ 0, 001, rm-ANOVA, Fig. 6a). Pour déterminer si le résultat statistiquement différent entre les auxotrophes et les prototrophes était prévisible, nous avons tenté de prédire la richesse spécifique en fonction de la croissance dans les monocultures. À cette fin, les paramètres de croissance ont été déterminés expérimentalement dans le même milieu supplémenté en vitamines utilisé pour les expériences de co-culture (Fig. 6b). À l'aide de ces données, nous avons paramétré un modèle consommateur-ressource et simulé l'abondance attendue de chaque souche dans les co-cultures supplémentées en vitamines. En bref, la concentration de glucose a été mise à jour de manière itérative pour simuler une éventuelle limitation du carbone dans une culture discontinue, les taux de croissance ont été mis à jour en fonction de la cinétique Monod et aucune interaction entre les espèces n'a été incluse (voir Méthodes pour les détails de modélisation). A partir des abondances simulées, nous avons calculé la richesse spécifique théorique. Nous avons constaté que dans le groupe prototrophe, la simulation capturait qualitativement la richesse en espèces observée expérimentalement (ligne bleu clair par rapport à la ligne bleu foncé sur la figure 6c) et prédisait correctement la richesse en espèces finale. Toutes les espèces auxotrophes ont été perdues dans la simulation (ligne rouge clair par rapport à la ligne rouge foncé sur la figure 6c), comme prévu en raison de leurs taux de croissance et de leurs rendements inférieurs par rapport aux souches prototrophes (figure 6b).

a Richesse spécifique des co-cultures cultivées en milieu vitaminé. Données sources dans Source Data 6. b Taux de croissance et rendements déterminés expérimentalement (= capacité de charge) pour chaque souche poussant dans le milieu enrichi en vitamines. Données sources pour les taux de croissance dans les données sources 9 et pour les rendements dans les données sources 10. c–f Richesse en espèces telle que modélisée par les modèles consommation-ressources. Les barres d'erreur pour les modèles ont été obtenues via des analyses de sensibilité comme suit. En c et d, le seuil pour qu'une bactérie compte comme « présente » variait de 0,1 % à 1 % de l'abondance totale. En e, le seuil de vitesse de croissance pour les bactéries qui ont été définies pour sécréter la deuxième source de carbone variait entre 0,3 h-1 (n = 15) et 0,6 h-1 (n = 3). En f, l'efficacité des auxotrophes à utiliser préférentiellement la deuxième source de carbone variait de 2 à 5 fois celle des prototrophes. Données sources dans Source Data 6.

Données sources 6Données sources 9Données sources 10.

La contradiction apparente entre le modèle consommateur-ressource et les données expérimentales nous a incités à explorer si une extension des modèles pourrait capturer la richesse en espèces observée. Nous avons commencé par mettre en place un terme d'alimentation croisée en vitamines, qui n'était pas inclus dans le modèle initial. À partir des mesures exométaboliques (Fig. 5), nous avons appris que les prototrophes sécrètent des vitamines dans le milieu, augmentant ainsi au moins de manière transitoire sa concentration en vitamines. De plus, le séquençage du gène ARNr 16S d'échantillons dérivés de cultures auxquelles aucune vitamine n'a été ajoutée a indiqué que l'augmentation observée de la concentration en vitamines lors de la co-culture avec des prototrophes était suffisante pour soutenir la croissance des auxotrophes (Fig. 4). Si la concentration en vitamines dans le milieu de croissance était devenue suffisamment faible pour limiter la croissance avant la limitation du carbone, ces vitamines supplémentaires auraient pu entraîner une augmentation du rendement. À cette fin, nous avons acquis des données de croissance dans une gamme de concentrations de vitamines physiologiquement pertinentes (Fig. 9 supplémentaire). Les différences observées dans le taux de croissance et le rendement étaient généralement faibles. Néanmoins, nous avons modifié la croissance de chaque souche dans le modèle de ressource consommateur des paramètres de croissance de chaque souche à 1 µM de vitamines à ceux cultivés dans 10 µM de vitamines, réduisant ainsi l'arrêt potentiel de la croissance précoce. Nous avons observé que cette augmentation simulée de la concentration en vitamines n'entraînait pas d'augmentation de la richesse en espèces auxotrophes prédite (Fig. 6d).

Les modèles de ressources de consommation avec alimentation croisée en vitamines n'ont pas capturé la différence observée expérimentalement dans la richesse en espèces (Fig. 6d). Un scénario alternatif pour la richesse élevée du groupe auxotrophe de la co-culture est qu'ils peuvent utiliser des sous-produits métaboliques comme sources de carbone. On sait que même dans des conditions aérobies, de nombreuses bactéries à croissance rapide fermentent leur source de carbone, entraînant la sécrétion de sous-produits tels que le pyruvate, l'acétate ou le succinate [40, 41]. Ainsi, les changements dans la composition de la communauté pendant la phase stationnaire (entre 9 h et 24 h ainsi que 96 h et 120 h) sont probablement dus à la (co-)consommation de sous-produits métaboliques après la consommation de la principale source de carbone, le glucose. Pour répondre à ce scénario, nous avons introduit une deuxième source de carbone, imitant efficacement la sécrétion d'un composé tel que l'acétate par des souches prototrophes à croissance rapide (Fig. 6b) dans le modèle. Nous avons ensuite permis à toutes les souches à croissance lente de se développer sur cette ressource nouvellement disponible à des taux proportionnels à leur taux de croissance sur le glucose. Comme les auxotrophes étaient enrichis dans le groupe à croissance lente, ils ont pu utiliser préférentiellement le sous-produit, tout en donnant au groupe prototrophe une chance égale de se développer sur le substrat sécrété étant donné que la condition limite de croissance lente était remplie (voir Fig. 10 pour plus de détails sur la concentration et l'effet sur le nombre total de cellules). L'ajout du terme d'alimentation croisée en carbone a en effet amélioré les prédictions par rapport au modèle original ; les deux groupes perdent en richesse spécifique mais aucun des deux groupes n'est entièrement perdu, et la richesse spécifique se stabilise finalement (Fig. 6e). Ce modèle, cependant, prédit toujours que le groupe prototrophe aura une richesse spécifique finale plus élevée. Nous avons donc donné auxotrophes un accès préférentiel à la nouvelle source de carbone disponible en augmentant leur affinité avec le substrat. Dans ce scénario, les modèles ont capturé la dynamique qualitative déterminée expérimentalement (Fig. 6f). Dans l'ensemble, cette analyse suggère qu'une capacité accrue d'alimentation croisée des sources de carbone détermine le succès des souches auxotrophes dans les co-cultures.

Les coenzymes sont non seulement omniprésentes mais aussi généralement conservées dans tous les domaines de la vie. Ils élargissent la boîte à outils catalytique des protéines et agissent comme des molécules porteuses pour les acides organiques et les unités à un carbone [1]. Ici, nous avons caractérisé les exigences auxotrophes des bactéries environnementales isolées de la phyllosphère d'A. thaliana et exploré les traits génomiques et physiologiques qui coexistent avec l'incapacité à synthétiser les vitamines. Nous avons constaté que l'auxotrophie vitaminique était courante pour la biotine, la niacine, le pantothénate et la thiamine et que l'auxotrophie était systématiquement associée à l'absence de gènes spécifiques sur les voies de biosynthèse respectives. Bien que d'autres études aient rapporté l'absence de certains des gènes identifiés dans cette étude chez d'autres auxotrophes [7, 8], d'autres études seront nécessaires pour évaluer si l'auxotrophie est généralement causée par la perte de ces quelques gènes spécifiques. De plus, nos analyses expérimentales et bioinformatiques ont défini un ensemble de fonctions spécifiques auxotrophes ainsi que l'alimentation croisée et le stockage des coenzymes dans divers isolats bactériens naturellement auxotrophes.

Après qu'une souche perd une voie de biosynthèse, elle devient dépendante d'une source externe de ce nutriment. Par conséquent, sa niche sera limitée à ceux qui ont un accès au moins occasionnel à cette ressource. Par conséquent, les populations de souches peuvent perdre la capacité de synthétiser tous les composés que la niche forcée peut fournir. En effet, nous observons des auxotrophes multiples chez quatre auxotrophes confirmés sur cinq (Fig. 1). Il a déjà été démontré que l'alimentation croisée des nutriments favorisait la coexistence [42]. Dans un système à deux souches, une souche "bénéficiaire" (mutante de perte de synthèse) n'a pas surpassé la souche "auxiliaire" qui a fourni le nutriment. Si une troisième souche fournissant le même nutriment était impliquée, le bénéficiaire a surpassé la souche auxiliaire ; ainsi, un métabolite échangé ne peut stabiliser qu'une communauté composée de deux souches. Les communautés trouvées dans la nature peuvent avoir des centaines ou des milliers de membres. Par conséquent, plusieurs auxotrophes sont nécessaires pour chaque souche auxotrophe pour les interactions d'alimentation croisée afin de stabiliser de grandes communautés. Comme nous observons des auxotrophes multiples chez 80 % des auxotrophes, ils peuvent contribuer à la stabilité observée de la communauté [30, 43] par alimentation croisée. Par conséquent, nous suggérons que l'identité du composé requis est dictée par la niche, mais le nombre d'auxotrophes par souche est plutôt une propriété inhérente à la communauté. Bien que largement oligotrophes, il existe des quantités détectables de sources de carbone (glucose, méthanol, saccharose, fructose) [44], d'acides aminés et même de vitamines à la surface des feuilles, rendues disponibles soit par la plante hôte elle-même, soit par les bactéries habitant la niche [6 , 45, 46]. Aucune auxotrophie pour la vitamine B12 métaboliquement coûteuse (qui n'est pas utilisée dans le métabolisme des plantes) n'a été observée (Fig. 11 supplémentaire).

Les génomes des populations bactériennes changent en réponse à la pression de sélection imposée par leur environnement et sous forme d'effets aléatoires, par exemple la dérive génétique. Par exemple, la biosynthèse de divers composés nécessite une allocation des ressources cellulaires en termes d'énergie (principalement ATP et coenzymes redox) et de synthèse protéique, c'est-à-dire un coût. À condition que le produit d'un tel processus biosynthétique soit disponible dans l'environnement, les organismes qui perdent la capacité biosynthétique pour ce composé évitent le coût. Dans un certain nombre d'études, il a été avancé qu'en évitant le coût de la biosynthèse, les cellules acquièrent un avantage de fitness, ce qui permet un avantage sélectif de la perte de biosynthèse - cette théorie s'appelle l'hypothèse de la reine noire [4, 13, 39]. Cependant, la perte de biosynthèse peut également être neutre et causée par la dérive génétique. Des génomes plus petits sont souvent observés chez les bactéries isolées dans des environnements de croissance riches et sont fortement liés aux modes de vie endosymbiotiques et parasitaires [32, 47,48,49]. Il n'est cependant pas possible de déduire le mécanisme entre la sélection et la dérive génétique sur la base de la réduction observée du génome.

La réduction du génome peut se produire de deux manières : 1. réduction générale du génome et 2. perte de gènes spécifiques [42]. Dans cette étude, nous avons observé l'absence à la fois spécifique et générale de gènes. Cependant, la majeure partie de la réduction du génome relevait de la première catégorie, car nous avons observé des génomes jusqu'à 19 % plus petits chez les auxotrophes, dont moins de 1 % peuvent s'expliquer par l'absence de gènes directement liés à l'auxotrophie (Figs. 2 et 3) . Nous avons également observé une réallocation génomique et métabolique, en particulier chez les auxotrophes de la niacine (Fig. 3b, c). Nos analyses indiquent également que les bactéries auxotrophes ont plus d'enzymes qui nécessitent la vitamine pour laquelle elles sont auxotrophes (en particulier la biotine et le NAD) que les prototrophes (Fig. 3b). Cette observation n'implique pas un chiffre d'affaires ou un besoin plus important pour la coenzyme, mais plutôt le nombre de réactions qui pourraient être perturbées par la limitation de la vitamine et donc l'impact que la limitation de la vitamine aurait sur le réseau métabolique. Que l'exigence elle-même reste constante ou même diminue dépend de la mesure dans laquelle les gènes sont traduits. Nous émettons l'hypothèse que le degré de dépendance (ici défini par le nombre d'enzymes utilisant la coenzyme) pourrait ne pas avoir autant d'impact sur les auxotrophes que sur les prototrophes, car les prototrophes pourraient minimiser leur dépendance à la coenzyme en raison du coût de la biosynthèse des vitamines.

La proportion de gènes biosynthétiques présents dans une voie est souvent utilisée pour classer les bactéries en auxotrophes ou en prototrophes [10, 13, 16]. Nos résultats sont conformes aux travaux publiés précédemment [18], suggérant que la prédiction de l'auxotrophie basée sur la fréquence des gènes entraîne des prédictions inexactes. Nous avons également observé que, bien que des lacunes aléatoires dans les génomes en général et les voies de biosynthèse des coenzymes en particulier soient fréquemment observées, l'absence de 1 à 3 gènes spécifiques de biosynthèse des coenzymes par voie est fortement associée à l'auxotrophie observée (Fig. 2; Tableau 1). La perte de certains des gènes que nous avons identifiés ici a déjà été associée à l'auxotrophie auparavant [7, 8]. La question reste ouverte de savoir si l'auxotrophie est universellement causée par la perte de quelques gènes spécifiques. La précision de la prédiction des auxotrophes basée sur les données génomiques pourrait ainsi être améliorée, par exemple, en donnant un poids plus élevé aux gènes connus pour être couramment perdus dans les auxotrophes. Dans cette étude, nous avons pu prédire l'auxotrophie avec une exactitude, un rappel et une précision de 80 à 100 % en entraînant des modèles avec les caractéristiques sélectionnées (tableau 1).

Nous avons observé une plus grande robustesse à la limitation de la biotine dans certaines souches auxotrophes (Fig. 1), ce qui soulève la question du mécanisme de stockage. Chez les mammifères, le stockage de la biotine a été lié à l'acétyl-CoA carboxylase mitochondriale [50]. Dans les levures auxotrophes à la biotine, il a été suggéré que la biotinylation des histones sert de stockage potentiel de la biotine chez les Candida albicans auxotrophes, contrairement à la levure prototrophe à la biotine Saccharomyces cerevisiae qui ne biotinyle pas ses histones [51]. Dans sa forme la plus simple, le stockage pourrait être non spécifique et réparti entre les protéines qui se lient de manière covalente à la biotine en tant que groupe prosthétique. Cette hypothèse est étayée par l'observation que les auxotrophes de la biotine ont plus d'enzymes nécessitant de la biotine dans leurs réseaux métaboliques (Fig. 3b). La question de savoir si un nombre élevé d'enzymes dépendantes de la biotine est une stratégie de stockage dans les bactéries reste à tester, mais est étayée par une étude récente qui a montré que la rhizavidine se liant à la biotine servait au stockage de la biotine pour Rhizobium spp [52].

L'auxotrophie survient fréquemment au cours de l'évolution, et dans cette étude, nous avons identifié des auxotrophes dans tous les principaux embranchements du microbiote foliaire d'A. thaliana. De plus, dans cette étude (Figs. 4–6, Fig. 8 supplémentaire), nous observons, en accord avec d'autres études, que les auxotrophes persistent même dans les co-cultures sans vitamines avec des prototrophes [12, 14, 16]. Ces observations soulèvent la question de savoir si les auxotrophes ont un rôle désigné dans l'assemblage de la communauté microbienne. La dissemblance métabolique, au moins théoriquement et dans le cas de certains acides aminés, peut entraîner une alimentation croisée [26]. Nos résultats soutiennent cette idée car nous constatons que les auxotrophes et les prototrophes sont métaboliquement et phylogénétiquement différents les uns des autres. Dans cette étude, nous avons confirmé que les auxotrophes maintiennent bien leur population en l'absence de vitamines étant donné qu'ils sont cultivés avec des souches prototrophes qui leur apportent des vitamines. Par conséquent, nous supposons que les auxotrophes restent en arrêt de croissance jusqu'à ce que suffisamment de vitamines soient sécrétées pour reprendre la croissance, et que ce mode de vie déplace la pression de sélection vers une consommation efficace des sous-produits métaboliques libérés par d'autres souches.

Nous avons constaté que les souches auxotrophes réussissaient mieux dans les co-cultures enrichies en vitamines que prévu à partir de leur croissance dans des cultures individuelles. Un modèle consommateur-ressource paramétré par des données de taux de croissance et de rendement obtenues expérimentalement avec un terme d'alimentation croisée en carbone a suffisamment capturé cette observation. Comme la croissance des souches auxotrophes ne peut pas reprendre tant que les prototrophes n'ont pas sécrété suffisamment de vitamines, l'utilisation préférentielle d'une source de carbone sécrétée parallèlement à la vitamine pourrait donner aux auxotrophes un avantage concurrentiel. Nos résultats et nos conclusions sont conformes aux résultats précédents où la coexistence stable a été expliquée par la mise en œuvre d'un terme d'alimentation croisée du carbone non spécifique dans un cadre de modèle consommateur-ressource, et que la croissance sur ces sous-produits métaboliques est souvent comparable à la croissance sur le carbone primaire. source comme le glucose [35]. Notre cadre suggère que non seulement une telle facilitation métabolique favorise la coexistence, mais que la consommation préférentielle de sous-produits carbonés peut également représenter une stratégie viable pour éviter l'exclusion compétitive. Pris ensemble, nos résultats suggèrent que l'auxotrophie fait partie d'un mode de vie spécialisé dans la consommation de produits métaboliques d'autres bactéries et peut donc être bénéfique pour les bactéries libres qui font partie d'une communauté microbienne.

Toutes les souches At-LSPHERE utilisées dans cette étude ont déjà été publiées [30]. Tous les tests de croissance ont été effectués à 28 ° C pour les souches At-LSPHERE et à 37 ° C pour les souches d'E. coli [53]. La turbidité des cultures en flacon agité a été déterminée en mesurant la densité optique à 595 nm ("OD600") dans des cuvettes semi-micro (Bio-Greiner) à l'aide d'un Biophotometer Plus (Eppendorf). Les échantillons ont été dilués de manière appropriée pour maintenir les lectures de DO dans la plage linéaire. Pour les cultures par lots avec surveillance continue de la DO pour les plaques à 96 puits (fond plat TPP), Tecan Infinite M200 Pro a été utilisé à une agitation orbitale d'amplitude de 1 mm.

Le milieu de base était un tampon phosphate (2,4 g/l K2HPO4, 2,08 g/l NaH2PO4.2H2O) avec des sels minéraux (1,62 g/l NH4Cl, 0,2 g/l MgSO4.7H20). Du glucose a été ajouté à 20 mM et du pyruvate à 40 mM. Pour tous les composants du milieu, des stocks 10x ont été préparés, dissous dans ddH2O et stérilisés par filtre. Les vitamines ont été supplémentées lorsque cela était indiqué dans les concentrations suivantes : sel d'hémicalcium de l'acide D-pantothénique 1,05 μM, biotine 0,41 μM, riboflavine 1,06 μM, thiamine · HCl 1,19 μM, pyridoxal · HCl 0,98 μM, acide p-aminobenzoïque 1,09 μM, cobalamine 0,14 µM, acide lipoïque 0,24 µM, niacine 1,22 µM, acide folique 0,23 µM. Les 20 acides aminés L protéinogènes ont été supplémentés à 0,1 mM chacun, sauf que le L-tryptophane et la L-tyrosine ont été supplémentés à 0,05 mM. Des stocks 1000x ont été préparés pour toutes les autres vitamines et acides aminés à l'exception de la riboflavine et du tryptophane pour lesquels des stocks 100x ont été préparés.

La régression linéaire sur les données transformées en ln a été effectuée à l'aide de la fonction linear_regression de sklearn. Les points de données situés en dehors de l'échelle log-linéaire ont été omis. Les taux de croissance n'ont été calculés que pour les cultures ayant effectué au moins 2 doublements en phase exponentielle.

Dans les expériences d'épuisement (voir Fig. 1 et Fig. 2 supplémentaire), la croissance des cellules cultivées sur des milieux sans vitamines a été définie comme s'écartant du contrôle supplémenté si les critères suivants étaient remplis. Il devait y avoir au moins une différence de doublement de 0,25 dans le nombre total de doublements dans les cultures sans vitamines et supplémentées en vitamines. De plus, dans au moins deux des trois répétitions, le taux de croissance après la séparation de doublement de 0,25 a dû être réduit de 25 % ; dans la réplique restante, une réduction de 10 % a été considérée comme acceptable. Le stockage a été défini comme le nombre de doublements d'une souche effectués sans la vitamine à ce moment précis. Le milieu R2A solide a été obtenu auprès de Sigma.

Afin de cribler les 224 bactéries de la collection At-LSPHERE [30] pour la croissance dans 4 milieux (+vitamines et acides aminés, −suppléments, +acides aminés et +vitamines), chaque souche a été inoculée dans du R2A liquide à partir d'un R2A solide plaquer et laisser croître jusqu'à la phase stationnaire (24 h). Ensuite, 10 µl de pré-culture en phase stationnaire ont été inoculés dans 190 µl de chacun des 4 milieux pour une pré-culture d'une nuit à 28 °C sur un agitateur à 220 tr/min en trois répétitions biologiques. Les cultures principales ont été inoculées de la même manière et les mesures de DO ont été prises à deux moments : t = 0 et t = 24 h. La DO a été normalisée à la DO dans les puits témoins (sans cellules, remplis de milieu). Pour l'écran d'abandon avec 50 souches, le même protocole a été répété avec quelques modifications. Ici, 5 µl de pré-culture en phase stationnaire sur R2A ont été ensemencés dans 45 µl de chacun des 4 milieux (+vitamines et acides aminés, -suppléments, +vitamines, +acides aminés) et chacun des 30 milieux drop-out (chaque composé individuel dans Source Data 1) pour la pré-culture d'une nuit et à nouveau pour la culture principale. Toutes les 24 h, 5 µl de culture en phase stationnaire ont été transférés sur des plaques R2A solides et la couleur et la morphologie des colonies ont été comparées aux caractéristiques connues de chaque souche pour exclure les contaminations.

Chaque souche a été inoculée à partir de plaques R2A solides sur une plaque à 96 puits en triples biologiques et cinq réplicats techniques dans un milieu additionné de 20 acides aminés et de 4 vitamines : thiamine, niacine, biotine et pantothénate à un volume de culture de 200 µl. Les cultures principales ont été préparées le jour suivant en diluant 10 ul de chaque culture cellulaire dans du milieu frais. Après une nuit de culture, le stade exponentiel tardif a été atteint. Les cinq répliques techniques ont été regroupées dans un tube Eppendorf stérile de 2 ml et lavées deux fois en centrifugeant le tube de suspension cellulaire (10 000 tr/min, 2 min), en éliminant le surnageant et en dissolvant le culot cellulaire dans 1,5 ml de MgCl2 stérile. Après le deuxième lavage, les cellules ont été recueillies via une étape de centrifugation comme précédemment, et les culots résultants ont été dissous dans 50 ul de MgCl2. 5 µl de la suspension cellulaire résultante ont été inoculés dans 195 µl de cinq milieux contenant les 20 acides aminés et différant par les suppléments vitaminiques. L'un des milieux était un milieu témoin, et il comprenait les quatre vitamines comme milieu de préculture. Les quatre autres milieux manquaient chacun d'une des vitamines suivantes : thiamine, biotine, niacine ou pantothénate. La croissance a ensuite été contrôlée sur un lecteur de plaque Tecan (pour plus de détails, voir "Tests de croissance"). Après chaque 2 doublements, les cultures ont été diluées de manière appropriée pour maintenir une croissance exponentielle dans la plage linéaire du lecteur de plaques.

Rhizobium Leaf68 a été cultivé dans une culture de 20 ml dans un milieu contenant 20 acides aminés et de la biotine, de la niacine et du pantothénate. En phase exponentielle tardive (DO ~ 1), les cellules ont été collectées par centrifugation (10 000 tr/min, 2 minutes), suivie de deux cycles de lavage et de granulation avec 20 ml de MgCl2 stérile et 10 000 tr/min pendant 2 min. Ensuite, les cellules ont été recueillies par centrifugation et dissoutes dans 1 ml de MgCl2. Les cultures ont été inoculées dans quatre cultures en flacon agité avec 100 ul de cet inoculum : l'une des cultures a été supplémentée avec les 3 vitamines et un milieu d'élimination pour chaque vitamine, respectivement. La DO a été contrôlée une fois par doublement et le métabolome intracellulaire a été échantillonné comme suit. Les cultures ont été maintenues à 28 ° C dans un bain-marie agité et le volume de l'échantillon a été déterminé sur la base de la DO (1 / DO ml). Le volume déterminé de suspension cellulaire a été pipeté sur un filtre placé au-dessus d'un flacon aspirant pour éliminer le milieu. Les cellules se tenant sur le filtre ont été lavées avec 10 ml de dH2O qui a été maintenu à 28 ° C dans un bain-marie, et le filtre lavé a ensuite été transféré dans un flacon Schott contenant 8 ml de solution de trempe acidifiée froide (-20 ° C) (3 parties MeCN : 1 partie de MeOH : 1 partie d'acide formique 0,05 M). Après 10 minutes, la solution de trempe a été transférée dans un tube Falcon de 50 ml et lyophilisée à -50 ° C pendant la nuit. La poudre résultante a été dissoute dans 250 µl de dH2O pré-refroidi et conservée à -80 °C jusqu'à l'analyse.

La séparation LC a été réalisée avec un système UHPLC Thermo Ultimate 3000 (Thermo Scientific) à un débit de 500 µl min–1. Deux méthodes de séparation différentes ont été appliquées. La première séparation a été réalisée par interaction hydrophile (HILIC ; colonne Aquity UHPLC BEH Amide [100 × 2,1 mm, 1,7 µm de tailles de particules ; Waters]) comme décrit dans [54]. Pour l'analyse HILIC, 50 µl de l'échantillon aqueux ont été séchés (SpeedVac) et dissous dans du MeCN. La séparation en phase inverse C18 (C18RP) a été réalisée à l'aide d'une colonne Kinetex XB-C18 (taille des particules 1,7 µm, taille des pores 100 Å ; dimensions 50 × 2,1 mm2, Phenomenex) comme décrit ailleurs [55]. Pour l'analyse de masse, l'instrument LC a été couplé à un instrument Thermo QExactive plus (Thermo Fisher Scientific), et le spectromètre de masse a fonctionné en mode FTMS positif et négatif à une résolution de masse de 30 000 (m/z = 400). Une sonde d'ionisation par électro-pulvérisation (ESI) chauffée a été utilisée en appliquant les paramètres de source suivants : vaporisateur 350 °C ; gaz auxiliaire 5 ; tension de pulvérisation ionique +3,5 kV, gaz gaine, 50 ; gaz de balayage, 0 ; niveau de fréquence radio, 50,0 ; température capillaire, 275 °C. Pour analyser les données, une extraction ciblée des chromatogrammes ioniques a été réalisée à l'aide d'emzed2 [56]. Les fenêtres de temps de rétention ont été déterminées sur la base des normes chimiques, et les fenêtres sélectionnées ont été normalisées au signal de fond.

En tant que pré-expérience, le nombre d'UFC par unité de DO a été déterminé à l'aide d'une méthode de placage par dilution. Les colonies ont été comptées à partir d'une dilution permettant la détermination à partir de points de 5 µl (tableau supplémentaire 5). Les 20 souches ont ensuite été inoculées à partir de plaques R2A solides dans un milieu liquide contenant 20 acides aminés et 10 vitamines et cultivées pendant une nuit en triples biologiques dans un volume de culture de 10 ml. Après la pré-culture, toutes les souches étaient en phase stationnaire. La DO de chaque culture a été mesurée et ajustée à 5e8 cellules par ml. Ces cultures ajustées ont ensuite été combinées dans un inoculum où chaque souche avait une abondance d'environ 1/20. L'inoculum a été lavé comme décrit dans la section "Préparation des échantillons pour l'analyse LC/MS des expériences d'épuisement". Cinq échantillons de séquençage ont été prélevés sur chaque inoculum, et trois répétitions techniques dans des milieux supplémentés en vitamines et sans vitamines ont été inoculées à partir de chaque inoculum. Les volumes de culture étaient de 20 ml et les cultures ont pu se développer à 28 ° C avec une agitation orbitale à 200 tr / min. À 9, 24, 48, 72, 96 et 120 h, des échantillons pour le séquençage du gène de l'ARNr 16S et l'exométabolomique ont été prélevés comme suit. Pour le séquençage du gène de l'ARNr 16S, un échantillon de 1 ml a été transféré dans un tube d'extraction d'ADN du kit FastDNA SPIN pour le sol. Les tubes ont été centrifugés (10 000 tr/min, 5 minutes, 4 °C), les surnageants ont été éliminés et les tubes avec les culots cellulaires ont été congelés et conservés à -80 °C jusqu'à l'extraction. Pour l'exométabolomique, 1 ml de culture a été transféré dans un tube Eppendorf de 2 ml et centrifugé (10 000 tr/min, 5 min, 4 °C). 200 µl de surnageants ont été stockés en deux réplicats techniques sur une plaque à 96 puits et conservés à -20 °C jusqu'à l'analyse (voir « Analyse LC/MS » pour plus de détails).

L'ADN a été extrait à l'aide du kit FastDNA SPIN pour sol (MP Biomedicals) en suivant les instructions du fabricant. Les échantillons ont été transférés dans des plaques à 96 puits à faible liaison d'ADN (Frame Star 96, semijupe), la concentration d'ADN a été quantifiée à l'aide d'ADN double brin QuantiFluor (Promega) et normalisée à 1 ng µl-1. La bibliothèque d'amplicons du gène ARNr 16S a été générée comme suit. L'amplification par PCR, le nettoyage et la PCR par code-barres ont été effectués comme dans [57]. La concentration d'ADN a été déterminée comme ci-dessus, et chaque puits a été normalisé à 1 ng µl-1. Un volume égal de chaque puits a ensuite été combiné dans une bibliothèque d'amplicons de gènes d'ARNr 16S regroupés, et la bibliothèque a été nettoyée deux fois avec des billes magnétiques AMPure en utilisant un rapport billes sur ADN de 0,9 pour éliminer les petits fragments d'ADN. La distribution de longueur d'amplicon de la bibliothèque a été évaluée sur une TapeStation 2200 à l'aide de HS D1000 (Agilent), ce qui a donné une taille de bibliothèque effective de 554 à 643 pb. Le séquençage a été effectué pour des échantillons de 12 pM sur un séquenceur de bureau MiSeq (Illumina) au Genetic Diversity Center de Zurich à l'aide du kit de réactifs MiSeq v.3 (extrémité appariée, 2 × 300 bp, 600 cyc PE). La dénaturation, la dilution et l'ajout de 15 % de PhiX à la bibliothèque d'ADN ont été effectués conformément aux instructions du fabricant. Des amorces de séquençage personnalisées ont été utilisées comme décrit précédemment [30].

Le génome de chaque souche a été obtenu en interrogeant RefSeq avec les numéros d'accès dans Source Data 5. Les gènes ont été cartographiés en termes COG à l'aide d'un mappeur de lait de poule et toutes les souches ont ensuite été étiquetées comme auxotrophes ou prototrophes de manière itérative pour chacun des composés suivants : biotine, thiamine, pantothénate, niacine. L'analyse a été limitée aux termes COG pour lesquels une cartographie des voies est fournie (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/pathways/). Un tableau de contingence a ensuite été construit sur la base de la présence de chaque terme COG dans les auxotrophes et les prototrophes respectivement. Un test χ2 a été effectué sur le tableau de contingence, et les valeurs de p ainsi que des informations sur le groupe ayant la présence la plus élevée de chaque terme COG ont été stockées. Les valeurs p résultantes ont ensuite été corrigées à l'aide de la méthode Benjamini-Hochberg. Pour les termes COG significativement différents (valeur q < 0,05), une annotation fonctionnelle a été récupérée à partir de l'API de la base de données COG (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/api/cog/) et mappée à la biologie processus via KEGG (disponible auprès de Biopython). L'efficacité de la correction des tests multiples a été confirmée en générant des modèles aléatoires en mélangeant les étiquettes auxotrophie/prototrophie. Aucun terme COG n'était abondant de manière significativement différente entre les auxotrophes et les prototrophes assignés au hasard.

Pour créer des modèles permettant de prédire l'auxotrophie à partir d'annotations COG, nous avons formé des classificateurs d'arbres de décision basés sur le processus de sélection des caractéristiques présenté ci-dessus, ou des termes COG choisis au hasard dans chaque voie (500 randomisations). Tout d'abord, nous avons ajouté l'ensemble de données de 35 souches validées avec 28 souches supplémentaires de l'écran d'abandon présenté dans la Fig. 1 supplémentaire pour réduire le biais d'échantillonnage. Cet ensemble total de 63 a été divisé en ensembles de données d'entraînement et de test équilibrés utilisant 40 % des données pour les tests à l'aide de "train_test_split" et des classificateurs d'arbre de décision ont été générés avec "DecisionTreeClassifier" de la bibliothèque sklearn avec une profondeur maximale de trois nœuds.

Des modèles consommateurs-ressources ont été appliqués pour analyser le succès des auxotrophes dans les expériences de co-culture. Les modèles consommateurs-ressources sont des représentations de l'abondance d'un organisme en fonction de sa capacité à consommer une ressource donnée. Ici, nous avons appliqué un modèle consommateur-ressource pour déterminer l'abondance de chaque souche bactérienne en utilisant son nombre d'UFC observé expérimentalement (tableau supplémentaire 5), son taux de croissance (μ) et son rendement. La capacité de charge C pour chaque souche a été déterminée en multipliant son rendement maximal déterminé expérimentalement par le nombre d'UFC par DO (colonne UFC/OD dans le tableau supplémentaire 5). Tous les paramètres sont clarifiés dans le tableau supplémentaire 6.

À t = 0, l'abondance de chaque souche (CFU/ml) a été fixée à son abondance observée expérimentalement au début de l'expérience (la colonne CFU/ml dans le tableau supplémentaire 7) divisée par 4 (lorsque les souches ont d'abord été mélangées ensemble, en diluant l'abondance de chaque souche par un facteur 20, l'inoculum a été inoculé au 1/200 dans du milieu frais, et enfin multiplié par 1000 pour estimer les UFC/ml).

La concentration de chaque souche a ensuite été mise à jour pour chaque instant. Ici, le taux de croissance de la souche a d'abord été mis à jour selon la cinétique Monod

Où l'affinité du substrat Ks était supposée être proportionnelle au rendement de la souche (en termes de DO) et calculée en divisant le rendement maximal de toutes les souches par le rendement de chaque souche. Pour chaque souche, une équation différentielle ordinaire a été formulée pour décrire le changement de concentration de cette souche :

Où Cstrain est la capacité de charge ou le rendement de cette souche. Ces équations spécifiques à la souche ont été couplées à une ODE décrivant le changement de concentration de glucose où [Glucose] était initialement fixé à 20 mM.

Où la première partie sous la somme estime le taux de consommation de glucose de chaque souche à partir de ses paramètres de croissance (taux de croissance multiplié par 10). La consommation totale de glucose est ensuite estimée à partir des taux de consommation et du nombre de cellules à l'échelle de la capacité de charge. L'unité sous la somme est h−1. Le modèle a ensuite été résolu à l'aide du solveur odeint de scipy.

A t∈{24,48,72,96} une étape de dilution (1/200) a été simulée par ce qui suit :

La capacité de charge C a été déterminée pour chaque souche séparément comme décrit ci-dessus. Sur la base des données présentées à la Fig. 5, nous avons estimé que la concentration en vitamines augmentait au maximum de 10 fois en présence de souches prototrophes. Étant donné que 1 µM de vitamines ont été ajoutées aux cultures, nous avons répété la simulation décrite ci-dessus avec la capacité de charge CStrain pour chaque souche en fonction de leur rendement déterminé expérimentalement avec 10 µM de vitamines (Fig. 9 supplémentaire). Pour les souches pour lesquelles les données manquaient, l'augmentation moyenne de la capacité de charge a été utilisée à la place.

La deuxième source de carbone a été simulée en fixant un flux de sécrétion uniquement pour les souches dont la vitesse de croissance était supérieure à un seuil donné (variant de 0,3 -h à 0,6 h-1). Le flux de sécrétion a été réduit de 50 % par rapport au taux d'absorption du glucose. A t = 0, S2 = 0.

La sécrétion de S2 dans le milieu par les souches à croissance rapide a donc été contrôlée par

Le changement de concentration de [S2] était alors

La formule de concentration et de taux de production de S2 a conduit à une plage de concentration biologiquement réaliste (~ 5 mM; Fig. 10 supplémentaire). Côté réception, les taux de croissance pour S2 ont été estimés comme suit

Pour les simulations dans lesquelles les auxotrophes et les prototrophes étaient également efficaces, le paramètre Scaling_factor a été défini sur 1/3. Afin de rendre les auxotrophes plus efficaces, le facteur d'échelle a été fixé à 1 pour les auxotrophes et maintenu à 1/3 pour les prototrophes. La sensibilité de ce paramètre a été testée en le réglant dans une plage de 1/2 à 2. La concentration de chaque souche a été simulée comme suit :

Où \(C_{S_{2,\,Strain}}\) a été fixé à 70. Ce paramètre a été défini sur la base de la découverte que la croissance sur les sous-produits métaboliques peut être comparable à la croissance sur le glucose [49].

Les simulations ont été répétées pour le temps t∈{1,2,3,…,120}. A t∈{24,48,72,96}, la dilution a été simulée comme décrit ci-dessus.

Sauf indication contraire, toutes les analyses ont été effectuées sur une machine Windows exécutant Python 3.8 via Anaconda3 à l'aide de scripts personnalisés. Les données ont été traitées dans des cadres de données pandas (V 1.1.3), pour le calcul numérique, la bibliothèque numpy (V 1.20.1) a été utilisée, et la régression linéaire et la correction de tests multiples ont été effectuées via les modèles sklearn et stats (V 0.23.0 et V 0.12. 0, respectivement) implémentations. Pour les tests statistiques, des implémentations scipy (V 1.5.2) ont été utilisées. Les API ont été interrogées via des requêtes (V 2.22.0) et KEGG via Biopython (V 1.76). Les modèles métaboliques ont été générés à l'aide de CarveMe [33] (V 1.2.2) en suivant le tutoriel publié (https://carveme.readthedocs.io/en/latest/usage.html). Pour les données continues, un test t ou un test t de Welch a été effectué en fonction de la variance au sein de chaque groupe. Pour les données catégorielles, des tests χ2 ont été effectués. Le nombre de répétitions (n) et le type de test effectué peuvent être trouvés dans la légende de la figure respective.

Le code pertinent utilisé pour générer des modèles de ressources consommateur est disponible en tant que matériel supplémentaire. Les données brutes de métabolomique LC/MS pour les surnageants et les expériences d'épuisement sont disponibles dans MetaboLights https://www.ebi.ac.uk/metabolights/index (Accession ID MTBLS5309). Les données de séquençage brutes sont disponibles dans European Nucleotide Archive https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home?show=reads (Accession ID PRJEB55397).

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Nous remercions M. Schäfer pour son aide dans l'écran d'auxotrophie ainsi que la lecture critique du manuscrit, C. Vogel pour avoir fourni les annotations COG et l'évaluation des analyses phylogénétiques, S. Pfeilmeier pour son aide dans la conception expérimentale des expériences de co-culture, D. Demaj et P. Kirner pour leur assistance dans la préparation de la bibliothèque de gènes d'ARNr 16S, T. Stewart et J. Kurmann pour leur assistance expérimentale dans les expériences de titrage de la vitamine. Nous remercions L. Hemmerle, P. Kiefer et P. Keller pour des discussions utiles, et A. Pacheco pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions le Centre de diversité génétique de Zurich et en particulier S. Kobel pour l'assistance technique et l'expertise en ce qui concerne les données de séquence, et C. Field pour le démultiplexage des données de séquence. Ce travail a été soutenu par le Fonds National Suisse de la Recherche Scientifique (subvention no. 310030B_201265).

Financement en libre accès fourni par l'Institut fédéral suisse de technologie de Zurich.

Institut de microbiologie, ETH Zurich, 8093, Zurich, Suisse

Birgitta Ryback, Miriam Bortfeld-Miller et Julia A. Vorholt

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BR et JAV ont conçu l'étude. BR a mené les expériences, les analyses et la modélisation. BR et MB-M ont réalisé des expériences de co-culture, d'échantillonnage et de préparation et de séquençage de la bibliothèque d'amplicons du gène ARNr 16S. BR et JAV ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Julia A. Vorholt.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Ryback, B., Bortfeld-Miller, M. & Vorholt, JA Adaptation métabolique à l'auxotrophie vitaminique par les bactéries associées aux feuilles. ISME J 16, 2712–2724 (2022). https://doi.org/10.1038/s41396-022-01303-x

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Reçu : 12 octobre 2021

Révisé : 13 juillet 2022

Accepté : 25 juillet 2022

Publié: 20 août 2022

Date d'émission : Décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41396-022-01303-x

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